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離心機(jī)區(qū)帶離心分離法介紹

2020-03-17(1670)次瀏覽

離心機(jī)密度梯度區(qū)帶離心法簡稱區(qū)帶離心法,區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡,在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同區(qū)帶的分離方法。此分離方法的優(yōu)點(diǎn)是:①分...

離心機(jī)密度梯度區(qū)帶離心法簡稱區(qū)帶離心法,區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡,在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同區(qū)帶的分離方法。此分離方法的優(yōu)點(diǎn)是:①分離效果好,可一次獲得較純顆粒;②適應(yīng)范圍廣,能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒,又能分離有一定浮力密度差的顆粒;③顆粒不會擠壓變形,能保持顆?;钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對流而引起混合。此分離方法的缺點(diǎn)是:①離心時間較長;②需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液;③操作嚴(yán)格,不易掌握。

離心機(jī)區(qū)帶離心法又可分為差速區(qū)帶離心法和等密度區(qū)帶離心法兩種:

(1)離心機(jī)差速區(qū)帶離心法:當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時(不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差)。在一定的離心力作用下,顆粒各自以一定的速度沉降,在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒(20%的沉降系數(shù)差或更少)或分子量相差3倍的蛋白質(zhì),與顆粒的密度無關(guān),大小相同,密度不同的顆粒(如線粒體,溶酶體等)不能用此法分離。離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液,樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上,離心時,由于離心力的作用,顆粒離開原樣品層,按不同沉降速度向管底沉降,離心一定時間后,沉降的顆粒逐漸分開,最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶,沉降系數(shù)越大,往下沉降越快,所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低,離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束,樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液,其最大密度和濃度可達(dá)1.28kg/cm3和60%。此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時間

(2)離心機(jī)等密度區(qū)帶離心法:離心管中預(yù)先放置好梯度介質(zhì),樣品加在梯度液面上,或樣品預(yù)先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管,通過離心形成梯度,這就是預(yù)形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。離心時,樣品的不同顆粒向上浮起,一直移動到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上,形成幾條不同的區(qū)帶,這就是等密度離心法。體系到達(dá)平衡狀態(tài)后,再延長離心時間和提高轉(zhuǎn)速已無意義,處于等密度點(diǎn)上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時間所影響,提高轉(zhuǎn)速可以縮短達(dá)到平衡的時間,離心所需時間以最小顆粒到達(dá)等密度點(diǎn)(即平衡點(diǎn))的時間為基準(zhǔn),有時長達(dá)數(shù)日。等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差,密度差越大,分離效果越好,與顆粒大小和形狀無關(guān),但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時間和區(qū)帶寬度。等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl,其密度可達(dá)1.7g/cm3。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等,也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì),但簡單蛋白質(zhì)不適用。

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